Váš prohlížeč není podporovaný - stránky se nemusí zobrazit správně. Použijte podporovaný prohlížeč.
 

slavek-mVIP

Barevný svět Fluorescenční & Laserové konfokální skenovací mikroskopie

61 fotek 3 videa květen 2014 až březen 2015 - zobrazení 37 komentářů
Tak jsem se koneně dokopal a vybral několik snímků z loňského roku z mikroskopie, většinou jde o snímky k mé práci, některé focené jen jako zkouška/testování/hraní si...U všech nsímků naleznete popisek, co na něm je!

Jen okrajově a hodně zjednodušeně zmíním rozdíly mezi fluorescenční a konfokální mikroskopií.
V obou případech musí být ve vzorku přítomen nějaký fluorofor ať už dodaný sondou/značenou protilátkou, nebo endogennícho původu! Bez fluoroforu neuvidíte nic ;)

Při fluorescenční mikroskopii je zdrojem světla halogenová výbojka nebo, jako zde, speciální LED zdroj (šetrnější k živým preparátům, možnost regulace, mnohem dražší) světlo prochází excitačním filtrem a dichroickým zrcátkem na vzorek (odfiltrování ostatních vlnových délek nepotřebných/nežádoucích pro excitaci). Excitační světlo je pohlceno fluoroforem, ten přechází na excitovaný vyšší energetický stav. Z toho se dostává opět na základní energetickou hladinu vyzářením fotonu o jiné vlnové délce, než jakou pohltil. Emitované světlo prochází dichroickým zrcátkem a emisním filtrem (odfiltrování excitačního světla a jiných vlnových délek, které nás nezajímají) a dopadá na CCD nebo CMOS (opět mnohem dražší) kameru. Zde sCMOS čip Andor Zyla 5.5.

V konfokální skenovací mikroskopii (LSCM či CLSM) je zdrojem excitačního světla laser (lasery) o jedné vlnové délce (odpadá nutnost excitačního filtru). Světlo laseru excituje fluorofor a emitující světlo prochází opět emisním filtrem. Prochází pinhole (odfiltrování signálu mimo rovinu zaostření) a dopadá na skenovací detektory. Zde se pohybuje zdroj světla a statický je preparát („beam scanning“), může ale být zdroj světla statický a preparát se pak pohybuje („stage scanning“). Jiný typ konfokálních mikroskopů místo skenovacích detektorů využívá rotující disk (SDCM).
Rozdíl v tvorbě signálu je ten, že u fluorescenční mikroskopie je obraz snímán jako ve foťáku po určitou expoziční dobu jako celek CCD/CMOS čipem. U konfokální skenovací mikroskopie je snímek řádkován scanerem a lasery. Signál na jednotlivé pixely dopadá jen velice krátkou dobu, proto je potřeba silného zdroje záření (laser) a citlivého zachycení (detektory - v našem případě supercitlivé GaAsP jednotky) a i přesto trpí snímky vyšším šumem. Výhodou je pak ale výrazná eliminace fluorescence mimo rovinu zaostření a tudíž lepší detekce jemných struktur (např. možnost zachycení struktury povrchu pylových zrn - viz. fotky na konec a na začátku; u fluorescenční mikroskopie by tyto jemné struktury zanikaly v signálu mimo rovinu zaostření).

Snímky samotného mikroskopu naleznete zde, koho to zajímá:
http://portal.faf.cuni.cz/Groups/Molecular-and-Cellular-Toxicology-Group/Equipment/
Schválně, kdo pozná, jakým objektivem byl focen mikroskop ve "tmě"? :) pro majitele Pentaxu by to mělo být jednoduché!

Náš mikroskop je vybaven těmito filtr-kostkami pro fluorescenční mikroskopii - kanály DAPI (modrá fluorescence), FITC (zelená), Cy3 (červená), Cy5 (vzdálená červená, tzv. Far-Red oblast)
Pro kofnokální mikroskopii jsou to pak následující lasery s příslušnými filtry (zde se dá kombinovat v případě potřeby)
UV laser o vlnové délce 405 nm, modrý emisní filtr 425-488 nm
modrý VIS laser o vlnové délce 488 nm, zelený emistní filtr 500-550 nm
zelený laser o vlnové délce 561 nm, červený emisní filtr 570-620 nm
červený laser 640 nm, far-red červený emisní filtr 663-738 nm

Buňky jsou pouze z následujících buněných linií:
H9c2 (potkaní kariomyoblasty)
NVCM (neonatální potkaní kardiomyoblasty)
3T3 (myší fibroblasty)
MCF-7 (lidský prsní karcinom)
HeLa (lidský cervikální karcinom).

K barvení buněčných preparátů byly použité následující fluorescenní sondy:
MitoTracker Green FM
MitoTracker Red FM
LysoTracker Blue DND-22
LysoTracker Red DND-99
JC-1
Hoechst 33342
Propidium Jodid
CellMask Green Plasma Membrane Stain
Monodansylcadaverin
Akridinová oranž
nově syntetizované ftalocyaninové a azaftalocyaninové fotosenzitizéry

Ve všech případech buněčných fotek jde o buňky živé a nefixované! Tzv. Live-Cell Imaging (náročnější na přístrojové vybavení a rychlost práce, ale jednodušší na příprava vzorku; nutnost pro sledování dynamiky děje)
U rostlinných preparátu na konci alba nebylo použito žádné barvení - jde pouze o autofluorescenci živé rostlinné tkáně a narychlo udělané preparáty.

Komentáře

nebo přihlásit Komentář lze odeslat klávesovou zkratkou shift + enter

Komentáře

nebo přihlásit
Komentář lze odeslat klávesovou zkratkou shift + enter

Rajce.net je největší česká sociální síť
zaměřená na sdílení fotografií a videí.

Nabízí neomezený prostor zdarma, snadnou a rychlou výrobu fotoknih i jiných fotoproduktů.